Method Article

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetic sistemleri hücresel prosesleri değiştirebilir ve ışık spesifik dalga boylarında yanıt olarak şekil değiştirirler genetik olarak kodlanmış proteinleri kullanılmaktadır. Optogenetic sistemlerin aydınlatma ve stimülasyon programlanan kullanan sistemler kültürlenmesi ve ölçülmesi için bir ihtiyaç vardır. Biz bina ve ışık programlanmış dozlarda mikrobiyal hücrelerin aydınlatmak ve otomatik olarak kazanmak ve atık hücrelerin görüntülerini analiz etmek için sürekli bir kültür cihazı kullanılarak bir protokol mevcut. Bir kemostat bu düzeneğin çalışması büyüme ve hücre ortamı sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. sürekli hücre kültürü atık düzenli örneklenmiş ve hücreler çok kanallı mikroskobu ile görüntülenmiş. floresan yoğunluğu ve kültür mahsulünden örneklenen hücrelerin hücresel morfoloji dinamik tepkiler birden fazla gün boyunca ölçülen böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik olankullanıcı girişi olmadan. Dinamik olarak transkripsiyonu aktive bir Optogenetic sistemi ile işlenmiş, Saccharomyces cerevisiae protein üretimini indükleyen bu kültürleme cihazının kullanımını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetic sistemleri gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5 protein lokalizasyonu, 6 protein aktivitesini, 6, 7, 8 protein bağlama, 8, 9, 10 ve protein degradasyonunu da dahil olmak üzere hücresel süreçleri artan listesini kontrol etmek için ışık kullanır. Programlı optik stimülasyon ile kontrollü bir ortamda hücrelerin kültüre ve biyolojik ilgili zaman ölçekleri üzerindeki tepkisini ölçmek için 11 bir yöntem hücre biyolojisi ve biyoteknoloji araştırma için bu araçların potansiyelini gereklidir. Önerilen yöntem, AE, iyi karışmış sürekli bir hücre büyüme hızını sabitlemek için chemostasis yararlanırpuan ve programlanan aydınlatma maruz sıcaklık kontrollü cam kültürleme kabı 12, 13. bir inverted mikroskop ile kültür atık suyunda görsele tek tek hücreler programlanmış aydınlatma kültür tepkisini ölçmek için. floresan yoğunluğu ve atık hücre kültürünün hücresel morfoloji kullanıcı girişi olmadan birden fazla gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Bu protokol, büyüyen hücre kültürü ve mikroskopi aşina en laboratuvarlarında uygulanabilir ve kullanılan cihaz ucuz ve kolaylıkla temin edilebilen bileşenler yapılmıştır. Şeffaf bir kültürleme kabı ışık 1 uW / cm2 -10 mW / cm2 yayabilen ışık yayan diyotlar (LED), bir matris üzerine yerleştirilir. Mikroplar sürekli kültür kabında yetiştirilir; bir peristaltik pompa de medya eklemek için kullanılırseyrelme oranı, bir mikroskop daha az bir oranda kültür çekmek için kullanılır ve fark, taşma çıkışı kaçar. Bir ısıtma yastığı sıcaklığını koruyor. Hava sürekli pozitif basıncı muhafaza etmek ve karıştırmak ve havalandırmak için kültür kültür kabına pompalanır. Hava pompası dışında, bu cihazlar için güç aynı zamanda bir termometre ve bağlı masaüstü bilgisayardan giriş alır bir mikro denetleyici tarafından düzenlenir. atık hücre kültürü ters bir mikroskop sahnede bir mikroakışkan cihaz pompalanır. Floresan olmayan ve floresan görüntüler otomatik olarak elde edilir. Görüntülerde hücreler ilgi (ROI) bir bölge olarak her bir hücreyi bulur ve her ROI özelliklerini ölçen bir algoritma ile karakterizedir.

Bu protokolün bir uygulama göstermek için, bir mavi ışık responsi ile mühendislik Saccharomyces cerevisiae hücreleri değişen ışık şiddetlerinde yanıt ölçülenfloresan protein transkripsiyonunu kontrol eden Optogenetic Sistemi. Bu sistemde gen ekspresyonunu kontrol etmek için çok sayıda Optogenetic sistemleri zaten 14, 15, 16 bulunduğu için yaygın olarak ekmek mayası olarak bilinen, S. cerevisiae, seçilmiştir. Bundan başka, bu model organizma yaygın sistem biyolojisi 17 ve biyo teknolojik uygulamalarda 18, 19, 20 için bir şasi gibi çalışmaları için kullanılır. Bizim Örnek Sonuçlar Bu protokol, giriş ışık değişen yoğunluklarda ve flüoresan raportör üretimini ölçerek çok gün boyunca kültürü transkripsiyonunu kontrol etmek için kullanılabileceğini gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

Şekil 1: Sürekli kültür aparatı. Bu basitleştirilmiş diyagramıdır cihazı lambası, kültür için kullanıldığında birleştirilmiş ve mikropların optik özelliklerini ölçmek nasıl olması gerektiğini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-protocol-2
Şekil 2: protokolün genel bakış. gölgeli bölgedeki adımlar protokol kullanıldığı her zaman yinelenmesi gerekir. Kapalı döngü kontrolü mümkündür 34 olduğunu, ancak bu protokol uygulanmadı.

1. Devre Kurulu Termometre birleştirin


Şekil 3: Bağlantılar termometre değerlerini okumak için. Bu diyagram mikro kültürünün sıcaklığını kontrol etmek geribildirim almak, böylece dijital termometre PCB bağlanması gerekir gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
  1. delikler aracılığıyla işaretli kendi dijital termometre Ground, Veri ve pozitif gerilim hatları lehim "GD + V."
  2. Bir kadın 3 pinli başlığından bir pin off klibi ve "R2" etiketli iki geçiş delikleri içine sığacak ve mikrodenetleyici engel olamaz, öyle ki tel makasları ile kalan 2 işaretçilerine kırpın. yerinde bu lehim. pim başlığındaki 4,7 kÊ direnci takarak iki lehimli işaretçilerine bağlayın.

2. Güç Con bağlayınDevre Kurulu kumanda Bileşenleri

figure-protocol-3
Şekil 4: Bağlantılar ısıtma pedi güç kontrol etmek. Bu şema PCB ve aksesuar parçaları ısıtma yastığı güç kontrol etmek amacıyla monte edilmelidir gösterir. parça peristaltik pompalar benzer bir şekilde bağlanır kontrol etmek. termometre için bileşenler netlik için kaldırılmıştır unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Beş kadın 3-pin başlıkları pimleri 1 cm keserek. (PCB) "# 1", "# 2", "3.", "4. olarak işaretlenen baskılı devre kartı üzerindeki pozisyonları bu lehim" ve "CB E."
  2. Bir kadın 6-pin ve 8-pin başlığının pimleri 1 cm keserek. için yan Bu yan Lehimgeçiş delikleri sütun K14 ile K1 etiketli.
  3. Devre kartına ısıtma yastığı bağlayın.
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K1 ve K2 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir metal-oksit yarıiletken alan etkili transistör (MOSFET) yerleştirin, böylece kaynak pimi "# en yakın geçiş delikleri K14 ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 1. işaretli # "etiketi" etiketi ve drenaj pimi uzak "dedi.
    2. 5 V doğru akım (DC) güç kaynağı kablosu Toprak hattını kesmek ve J2 bağlayın. J1 ısıtma yastığı toprak hattını bağlayın. 1 kÊ direnci ile 3 pin K3 bağlayın. pin 3 + 5V.z olarak ayarlandığında Güncel artık sadece J2 için J1 akmalıdır
      NOT: mikrodenetleyici pin 3 5 V. ayarlandığında J2 pin J1 dan akımın sağlayan bir anahtar olarak direnç / MOSFET set fonksiyonları
  4. bağlamakYavaş peristaltik pompa.
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K4 ve K5 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir MOSFET yerleştirin, böylece kaynak pimi "#" etiketi en yakın olan ve tahliye pimi uzak olduğunu geçiş delikleri K14 ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 2. işaretli "#" etiket.
    2. Yavaş peristaltik pompa 12 V DC güç kaynağı kablosunun toprak hattı kesti. J3 uca ve J4 uca bakan duvar siğil bakan peristaltik pompa bağlayın. 1 kÊ direnci ile 4 pin K6 bağlayın. pim 4 5 V. ayarlandığında Güncel artık sadece J4 için J3 akmalıdır
  5. Hızlı peristaltik pompa bağlayın
    1. PCB üzerinde geçiş delikleri etiketli K7 ve K9 içinde 100 kÊ direnç uçlarını takın. pozisyona bir MOSFET yerleştirin K14 geçiş delikleri s ile K1 doğru bakan MOSFET etiketi, PCB üzerindeki 3. işaretli Bu o kaynak pimi "#" etiketi en yakın olan ve tahliye pimi "#" etiketi uzak olduğunu.
    2. Hızlı peristaltik pompa 12 V DC güç kaynağı kablosunun toprak hattı kesti. J5 uca ve J6 uca bakan duvar siğil bakan peristaltik pompa bağlayın. 1 kÊ direnci ile 5 pin K9 bağlayın. pim 5 5 V. ayarlandığında Güncel artık sadece J6 için J5 akmalıdır

3. Devre Kurulu LED Matrix bağlayın

figure-protocol-4
Şekil 5: Bağlantılar LED matris kontrol etmek. Bu diyagram LED matris PCB bağlanması gerekir gösterir. Aynı zamanda PCB mikrodenetleyici yığılmış olabileceğini göstermektedir. termometre ve diğer cihazlara DC gücünü kontrol etmek için bileşenler netlik için kaldırılmıştır unutmayın.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. bu mikrodenetleyici üst üste edilecek şekilde PCB tarafta boydan boya deliklere 6-pin, 10-pin ve iki 8-pin dişi pin başlıkları lehimleyin.
  2. 10 jxF kondansatör (kısa kurşun) negatif terminali negatif işareti ile geçiş deliğinin bağlı gerektiğini belirterek, PCB üzerindeki işaretli konumlara 100 NF ve 10 jxF kapasitörler lehimleyin.
  3. uzak sürücüye girinti ile, geçiş delikleri 2 12 ile kümesine LED sürücü lehim aracılığıyla delikleri LED matrisi için saklıdır.
  4. LED matris için işaretli geçiş delikleri erkek pin başlıkları 2 sütun lehimleyin ve onlar mikrodenetleyici engel olmayacak şekilde breadboard altında bu uçlarını kırpın. dişi / dişi bağlantı kabloları iki 8 telli şeritler bu bağlayın. erkek ikinci bir set bağlayınbağlantı kabloları diğer ucuna pin başlıkları.
  5. breadboard medyan üzerinde LED matris yerleştirin ve sonra matrisin iki tarafında kolonlara pin başlıkları ikinci seti yerleştirin. LED matris doğrudan geçiş delikleri etiketli sütunda karşılık gelen matris etiketli tarafı ile PCB bağlı sanki elektrik bağlantıları aynı olduğundan emin olun.
  6. Bir kadın 3 pinli başlığından bir pin off klibi ve "R1" etiketli iki geçiş delikleri içine sığacak ve mikrodenetleyici engel olamaz, öyle ki tel makasları ile kalan 2 işaretçilerine kırpın. Bu lehim. pim başlığındaki 1 kÊ direnci takarak iki lehimli işaretçilerine bağlayın.
    Not: kültür gemi LED matris üzerinden yığılır. tel şeritler gemi engel olursa, matristen onları ofset. Ardından, elektrik bağlantıları ch yok böyle matris pimleri ve telli şeritli pimleri arasındaki uçurumu katı çekirdek tel kullanmakange.

4. Yazılımı Yükle ve Donanım bağlanın

  1. mikrodenetleyici PCB yığını.
  2. mikroişlemci için tümleşik geliştirme ortamı (IDE) ve özel kod indirmek için malzeme listesinde bağlantıları izleyin.
  3. Bir AB evrensel seri veri yolu (USB) kablosu aracılığıyla mikroskop bilgisayara mikrodenetleyici bağlayın. Derleme ve mikrodenetleyiciye özel kod yükleyin.
  4. Mikro-Yöneticisi 21, 22 ve Fiji 23 indirin. Tüm ".dll" dosyaları "mmplugins" dizini kopyalayarak FIJI eklenti ve Mikro-Yöneticisi "Fiji.app" dizine indirilen dizinindeki "mmautofocus" dizini olarak Mikro-Yöneticisi yapılandırın. Ayrıca, "Fiji.app/plugins" dizine "eklentileri / Micro-Yöneticisi" dizinine kopyalayın.
  5. "BioreactorController.jar" dosya int indirin"Fiji.app/mmplugins" dizinine o.
  6. FIJI> Eklentiler> Mikro-Manager> Mikro-Manager Studio Açık Mikro-Yöneticisi. mikroskop kontrol yazılımı yapılandırmak için Donanım Yapılandırma Sihirbazı kullanın. AB USB kablosu bağlı olduğu liman etiketi ile Sihirbazı "FreeSerialPort" cihazı bulunmaktadır.

5. olun ve Kültürleme Gemi Işık geçirmez Muhafaza karakterize

  1. kültür damar matrisinin üstünde onlara dinlenme öyle ki LED matrisin her köşesinde breadboard yapı taşları olarak üç 8 pinli IC yuva Stack.
  2. prizler üst tabakasının altında difüzyon kağıt bir kısmını sabitleyin, LED matris kültür gemi çarpıcı ışık dağınık böyle olduğunu.
  3. siyah köpük bölümleri "6 ile" üç 8 kesiniz. İlk tw içinden elektronik breadboard aynı boyutta bir kısmını (2.3 "x 3.5") Keso ve üçüncü içinden IC prizleri tarafından yapılan dikdörtgen (0.9 "x 1.8") boyutu bir kısmı. 0.9 "x 1.8" diyafram içeren son kat bile IC soketleri üst aittir ve LED matris çevreleyen şekilde LED matris üzerinden bu katmanları Stack.
  4. 6 "24" dikdörtgen yapmak için yarıda siyah köpük ek bir levha kesti. kültür gemi o termal ve optik kültür gemi izole edecek şekilde boru ve teller için oda ile sığabilir siyah köpük içi boş bir sütuna bu yuvarlayın.
  5. LED matris üzerinden siyah köpük içi boş sütun ortalayın ve altında siyah köpük tabakası üzerinde sütun sınırını işaretleyin. gelecekte merkezli olması gereken yerde, bu sınır işareti olacaktır.
  6. siyah köpük 3 "x 3" kısmını kesip. Harici ışık engellemek için sütunun üst bantlanmış edilebilir bir kapak olarak daha kullanın.
  7. inci fotodiyot güç sensörü takın e bantla geminin kap kültüre, kapağı takmak ve muhafazaya kültür gemi yerleştirin.
  8. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. 30 s aralıklarla olası yoğunluklarının aralığının bir alt kümesine aydınlatmak için matris olarak ayarlayın.
  9. Güç sensörüne bağlı güç ölçer konsolda görüntülenen ışık şiddetlerinde kaydedin. Bu ölçümler, bu LED'ler yaktı LED'lerin sayısı ve darbe genişliği modülasyonlu (PWM) akım ayarlandığında ışık gerçek yoğunluğu bilinen sağlayacaktır.

6. Kültürleme Gemi hazırlayın

figure-protocol-5
Şekil 6: Gemi bağlantıları. Bu şema düzeneğinin kap ve boru önce otoklavlanmıştır olan bağlanmalıdır gösterir."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Mark kültürleme kabı içinde, 30 mL, 10 mL aralığında sıvının her 2 ml artışına karşılık gelen yüksekliği. Steril deiyonize su 10 ml takın su seviyesini işaretleyiniz 2 mL ekleyin, su seviyesini işaretleyin ve 30 ml düzeyinde işaretlenmiş kadar tekrarlayın. kolayca kaldırılır ve böylece şeffaf bir bantla işaretler Kapak ve sıvı atmayın.
  2. kültür kabına, silikon conta yoluyla alüminyum bağlantı uzun ucu yerleştirin. kapağını tekrar.
  3. . 1/16 "ID silikon boru ile kısa bir alüminyum bağlantı çıkışı Kapak bir dişi luer kilit ekleme ve sonra bir erkek luer kilit fişi bağlayarak uzak ucunu. Bu çıkış tamamlayıcı ve Şekil 6'da (tüp 6 kullanılmayacaktır ).
  4. . Erkek ve dişi luer kilit ile 1/16 "ID silikon boru iki kısa kesimleri bağlayın kısa bir alüminyum bağlantı çıkışına bir ucunu ve Dista fişBir erkek luer ve dişi luer kilit fişi ile l sonu. Gemi bu tüp (tüp Şekil 6'da 7 / 7.1) ile inoküle edilecektir.
  5. Kimlik peristaltik boru ve konektörler "1/16 uçlarına kimlik tüpleri" İki 1/16 bağlayın. Kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bir ucunu ve (Şekil 6 tüp 4) diğer takın. Daha sonra, bu ortam şişeye bağlanır.

7. Medya Flask hazırlayın

  1. 1/16 "uzun alüminyum bağlantı noktasına iç çapı (ID) silikon tüp. tüp medya şişesi ulaşmak için yeterli uzunlukta olmalıdır. 1/8 bağlayın" Connect 1/16 kısa bir kesimine Kimlik erkek luer kilidi " kimlik tüp, önceki tüp bu bağlantı ,, ve daha sonra medya balona (Şekil 6 tüp 3) üzerinde lastik tıpa içine bu kısa segment yerleştirin.
  2. tüp kelepçe. Bu bağlantı, hava kültür kabına medya şişesi akmasına izin verir. Medya şişesi daha sonra havanın bir ile pompalanır zamanBu tüp kelepçelenmemiş olan d, kültür gazbeton, karışık ve gelen baloncuklar olumlu bir basınçta tutulacaktır.
  3. Bir 3/16 "ID tüp sonra". Medya transfer edilecek hangi aracılığıyla stoper, içine şişenin dibine ulaşmak için yeterince uzun kimliği tüp başka 1/16 bağlayın "1/16 takın bu bir kimlik tüp ve söyledi. bir 3/16 "ID dişi luer kilit ve bir erkek luer kilit fişi (tüp Şekil 6'da 1 / 1.1) ile bu takın.
  4. Stoper üçüncü delik uzak ucunda orta çaplı boru iki diğer kesimleri bağlı ve takılı, 1/16 "ID boru kısa bir segment ile doldurulmalıdır (tüp 2 Şekil 6'da / 2.1). Bu bağlanacaktır bir vakum pompasına ve daha sonra bir akvaryum pompası.
    NOT: boru kolayca lastik tıpa deliklerden sığmıyorsa, eğik boru uçlarını kesin. Daha sonra, delik içine itildiğinde eğimli uç aracılığıyla diğer parçalarını yakalamasına kullanılabilir.

  1. 1/16 bir segmentine bir erkek luer kilit takın "ID silikon tüp, ve sonra sıkıca 0.022 eklemek" Kimlik politetrafloroetilen (PTFE) boru. Ayrı, kilitler ve (Şekil 6 tüp 5) kısa bir alüminyum bağlantı noktasına, diğer bağlamak için PTFE tüp boyunca 1/16 "ID tüp. Sonra, iplik bir ucuna bir dişi luer kilit takın.
  2. Kimlik peristaltik tüp ve konnektörleri "1/50 ID silikon tüp" maruz 1/50 bağlayın. Bu amaçla, onları alternatif, 1/50 üç segment "Kimlik boru ve 0.022 iki segment" Kimlik PTFE tüp bağlayın. 1/16 "ID boru (Şekil 6 tüp 5) yoluyla atık balona bu bağlayın.
  3. Alüminyum port ikinci en uzun tüp ve atık balona diğer ucunu 1/16 "ID silikon tüpün bir ucunu. Bu alüminyum tüp kültür ses seviyesini ayarlar ve aşırı kültür atık konteyner (tüp 8 içine taşmaları
  4. 30 dakika süre ile 121 ° C ve 15 psi'de (genel sterilizasyon) kültürlendikten grubunu otoklava.
    Ortam Şişe vakum edilmesini sağlayan ortam şişe doldurulma ile tüpler, ve hangi kültürleme kabı aşılanmış uzak kademeli bir kirlenmiş olan, steril ortaya çıkarılabilir, böylece boru birden fazla segment: Not segmenti.

9. mikroakışkan Kanal hazırlayın

  1. : 1 oranında bir 9 polidimetilsiloksan (PDMS) ve sertleştirme ajanı karıştırılır. Degas ve silikon ana kalıp üzerine dökün.
  2. 65 ° C'de 2 saat boyunca PDMS tedavi etmek ve daha sonra bir jilet ile maskeden kesin. kalıptan serbest bırakana kadar PDMS etrafında kesti. aşağı iterek ve kırılgan gofret kesmekten kaçının.
  3. kanalın her iki uçta da delikler 1.2 mm İD biyopsi delgeç kullanın.
  4. Plazma bağ kapak cam 24 PDMS.
  5. uzun Bant PDMS kanalı alüminyum çerçeve üzerine ortalanması için, destekleyen alüminyum çerçeveye, cam biter ve daha sonra 65 ° C'de 2 saat boyunca daha PDMS fırında.

10. Dolgu Medya Flask

figure-protocol-6
Şekil 7: medya ekleme. Bu diyagram ortam ortam şişeye süzüldü, vakum nasıl olması gerektiğini gösterir. Bu medya steril kalmasını sağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Uygun ortamı olun. Sürekli kültür sistemi kemostat olarak ameliyat olacak olursa, belirli bir besin sınırlı ortamları kullanın.
    S. cerevisiae ile çalışmalar için standart medya kompozisyon örnekleri daha önce 25 yayınlanmıştır: NOT= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. daha sonra steril cımbız ile vakum filtre meme ucundan beyaz fişi, 100 ml'lik şişe vakum filtresi takın meme kapağını çıkarın.
  3. Meme için 3/16 "ID silikon tüp iletişime, bir vakum pompasına ortam şişeye diğer serbest boru (tüp sırasıyla 1 ve Şekil 7 'de 2) ve kültür kabına ortam balon bağlantı borusu sıkıştırıldığı sağlamak (Şekil 7 tüp 3) kapattı.
  4. , Medya ile filtreyi doldurun vakum pompası açın ve sonra da medyanın geri kalanını filtre. vakum (Şekil 7'de tüp 2) bağlanan 1/16 "ID silikon tüp Kelepçe ve vakum pompası kapatın.
  5. borunun kirlenmemiş bir ucu erişilebilir, böylece vakum pompasına bağlı 1/16 "Kimlik boru ara kesimden leurs çıkarın. th yerleştirinBu tüp içine steril bir şırınga hava filtresinin e mavi sonu.
  6. 3/16 "ID silikon tüp (Şekil 7'de tüp 1) Kelepçe ve ondan erkek luer ayırın. Kültürleme geminin medya giriş borusunun kadın luer olan bağlantısını kesin. Olmaya medyayı etkinleştirmek için bu erkek ve kadın dişlerde bağlayın kültür kabına pompalanır.
  7. Vakum filtresini çıkarın ve vakumlu filtreye takıldı medyanın 100 mL şişe kapağı.
  8. kültür gemi inoküle olacak bir gün önce, önceki adımda toplanan medya 4 mL test tüpünde optogenetic mikrobun tek bir koloni aşılamak ve 30 ° C veya kültürün optimum sıcaklık artışı sıcaklığında gece büyümesine izin çalkalanarak.

11. Mikroskop Çevresi Aparatı monte

  1. Ortam kültür kabı ve efflu daha yüksek şişe mikroskop yakınındaki sürekli kültürleme grubunu ayarlama0.022 "ID PTFE tüp (Şekil 6 tüp 5) segmentleri oluşan tüp mikroskop aşamaya ulaşmak öyle ki kültür kabından daha düşük ent şişesi. Güvenli ortam şişesi ve atık konteyner lastik tıpaları aşağı bantlayın.
  2. (Şekil 6 tüp 5) onları bağlayan ID silikon tüp 0.022 "1/50 dan kimliği PTFE tüp" uçlarını çıkarın ve mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış içine bu biter takın.
  3. akvaryum pompası şırınga hava filtresinin beyaz ucunu. Hava basıncı kültür kabına medyayı itecektir.
  4. Medya atık liman seviyesine ulaştığında, hızlı etrafında 1/16 "ID medya giriş tüp ve konnektörleri (Şekil 6 tüp 4) yavaş peristaltik pompa ve çevresinde 1/50" ID örnek çıkış boruları ve konnektörleri sarmak peristaltik pompa (Şekil 6 boru 5).
  5. Hava tu çözülmesini ile medya havalandırınOrtam şişeye ve kültürleme kabı arasında.
  6. sıcaklığı kontrol edilebilir, böylece kültür kabına ısıtma yastığı ve termometre kaydet. giren ortam kabı ile aynı sıcaklıkta olacak şekilde kültür kabına yaklaşık ortam boru sarmalı.
    NOT: ısıtma pedi PWM akım kendi set sıcaklığında kültür damarı tutmak için termometre girdileri kullanan mikro denetleyici tarafından düzenlenir.
  7. LED matris üzerinden siyah köpük muhafazanın içine kültür kabı yerleştirin ve tüpler sıkışmak değil emin olun.
  8. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. buharlaşma hızından 0.1 alanda "Medya pompa oranını" ve debisi çok düşük olacaktır 0'a alanında "konulu örnek pompa oranını", ama daha ayarlayın.
  9. Medya şişesi ve kültürleme geminin arasında gelen hava borusunu kelepçe. Şekil aşılama tüp (tüp 7 prizden çekin
  10. hiçbir ışık girer, böylece muhafaza Kapak ve kültür gecede büyümesine izin.

12. Kalibre Pompalama Oranları

  1. Mikro-Yöneticisi'nde, Eklentiler> Biyoreaktör Kontrolörü gidin. 0,5 sahada "Medya pompa oranını" ve 0 alanında "konulu örnek pompa oranını" olarak ayarlayın.
  2. Çıkış maddesi bir şişede (Şekil 6 boru 8) ve çıkış şişeye (Şekil 6'da boru 8) işletmeye alma tüpü taşma borusunu ayırın ve ayrı kaplarda çıkış maddesinin toplanması. pompa, 15 dakika açık kaldıktan sonra başlayan, 1 saat boyunca dışan akanı topla.
  3. kap olarak toplanan birimden kültür kabına ortamının akış hızı hesaplanır:
    figure-protocol-7
  4. Bu doğrusal tahmin tarafından sahada "Medya pompa oranı" değerini ayarlayın:
    figure-protocol-8
    nerede
    figure-protocol-9
  5. İstenen akış oranı ve ölçülen akış oranı arasındaki fark akış hızı 1 saatlik bir süre boyunca ortalama olarak <0.2 ml / saat, kadar bu kalibrasyon prosedürü yineleyin.
  6. Sahada "örnek oranı" değerini artırmak ve kültür kabını terkeden hacminin yaklaşık 4/5 inci örnekleme pompası tarafından pompalanan kadar benzer bir şekilde kalibre ve hacim yaklaşık 1/5 inci yoluyla bırakıyor taşma noktası.
  7. Sürekli kültür cihazı içinde kültür yoğunluğu gece bu şartlar altında dengelenmeye olsun.
    NOT: Hedef debileri ulaşılamazsa, değişiklikperistaltik pompa hortumu. büyük çaplı boru kullanıldığında sıvı daha yüksek bir pompalanır. adım 14 izleyin ve sonra 8.4 adıma geri dönün.

Kültür Mikroplar 13. toplayın Mikroskop Görüntüleri

  1. mikroakışkan kanal içine pompalanır hücrelerin görüntüleri odak düzlemi olacak hangi örtüşmeyen pozisyonlarda bir dizi mikro-Manager Sahne Pozisyon Listesini doldurun.
  2. "Biyoreaktör Kontrolör" eklentisi açın. istemleri istenen LED matris zamanlı kurs, görüntüleme kanalları ve diğer deneysel ayarları seçin. Toplayın ve görüntüleri analiz.
  3. Deney çalışırken, medya şişesi medya açık kalmasını sağlamak. bulutlu ise, o zaman kontamine olmuş.

14. Post-deney

  1. medya, aşırı hücre kültürü ve atık imha edin.
  2. iyonu giderilmiş su ile karıştırılarak% 20 EtOH 200 mL ortam şişesi doldurun. daha önce olduğu gibi kemostat çalıştırınHücre artıkları ve medya yıkamak için deney sırasında işletilmektedir.
  3. alkol çözeltisi medya şişeden boşaldığında, tamamen kemostat sökmeye.
  4. ılık su ve yumuşak bir deterjanla cam ve tüpler yıkayın ve deiyonize su ile iyice durulayın. kurumaya bırakın.
  5. Deney boyunca sıcaklık ve LED matris durumunu gözden geçirmek için "microcontrollerRecords.csv" dosyasını açın, "Summary.csv" dosya görüntülerin her setten özet verileri ve yorumlayan "Sonuçları .csv" dosyaları n veri setindeki inci n her zaman dilimi, her ROI özetleme verileri gözden geçirmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu aygıt, cry2 / CIB1 proteini çifti 30 göre, indüklenebilir kopyalama Optogenetic sistemi ile mavi ışığa karşılık olarak sarı floresan protein (YFP) ifade S. cerevisiae'nin kültürü teşvik etmek için kullanıldı. Hücreler 0.2 ± 0.008 ortalama seyrelme oranı ile fosfat sınırlı medyada chemostatically yetiştirilmiştir. Fosfat sınırlama genel olarak büyüme oranını kontrol etmek için, S. cerevisiae kemostat deneylerde kullanılan ve fosfat sınırlı etki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz esneklik düşünülerek bu cihazı tasarladı. Kullanılan tüm kod ücretsiz ve açık kaynak. Segment hücrelere varsayılan görüntü analizi süreci basit ve hızlı bir şekilde çalışır. Özel analizi, FIJI grafik kullanıcı arayüzü ile temsili bir görüntüsünü analiz eden bir Beanshell komut girişini dönüştürme ve sonra komut dosyasını çağırmak için eklenti ayarlarken kullanıcı girişi kayıt ile uygulanabilir. o çağrıldığında, bu komut arka plan çıkarılır görüntülerin en son setine dosya yollarını içeren "resimler" olarak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yararlı tartışmalar ve düzenleme için protokol, Kieran Sweeney test yardım için Molly Lazar ve Verónica Delgado kabul etmek ister ve yazının eleştirel okuma Taylor Scott, My An-adirekkun ve Stephanie Geller olacaktır. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fonu Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü sahibidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kapsamlı laboratuvar kılavuzuGitHubNAKapsamlı, düzenli olarak güncellenen bir laboratuvar kılavuzu şu adreste mevcuttur: " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Bu aynı zamanda temsili sonuçları oluşturmak için kullanılan mikroakışkan kalıbın bir tanımını da içerir.
Fritzing Design ViewerFritzingNA.fzz tipi devre kartı tasarımlarını görüntülemek ve düzenlemek için ücretsiz, açık kaynaklı yazılım "http://fritzing.org/download/" adresinde mevcuttur
Arduino Uno R3 (Atmega328 - montajlı)Adafruit50Mikrodenetleyici. 1 gereklidir.
Arduino İstiflenebilir Başlık KitiSparkFun Electronics10007Dişi pin başlıkları. 1 gereklidir.
Ayarlanabilir 30W 110V havya - XY-258 110VAdafruit180PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.
Havya standıAdafruit150PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.
Mini Lehim makarası - 60/40 kurşun reçine çekirdekli lehim 0.031" çap - 100gAdafruit145PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.
0.1 ve mu; F kondansatörSparkFun ElectronicsCOM-08375PCB'deki voltajı stabilize eder. 1 gereklidir.
10 & mu; F kondansatörSparkFun ElectronicsCOM-00523PCB'deki voltajı stabilize eder. 1 gerekli.
MAX7219CNG LED Matris/Rakam Ekran Sürücüsü - MAX7219MaximMAX7219CNGLED sürücüsü. 1 gereklidir.
8 pin IC SoketMouser Electronics575-14430816 gereklidir. Bunlar, LED matrisinin üzerindeki kültür kabını desteklemek için üst üste istiflenecektir.
24 Pin IC soketiMouser Electronics535-24-3518-10İsteğe bağlı. MAXIM 7219CNG sürücüsünü PCB'ye ters yönde takmak için bunu kullanın.
Dijital multimetreAdafruit2034Elektronik sorun giderme için. 1 gereklidir.
Break Away Başlıkları - 40 pinli Erkek (Uzun Merkezli, PTH, 0.1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Baskılı devre kartına bağlı LED matrisi için erkek pin başlıkları. Uçlar tel kesiciler ile kesilebilir. 1 set gereklidir. 
Gömme diyagonal tel kesicilerAdafruit152Uzun pim başlıklarını kırpmak ve güç kablolarını kesmek için. 1 gereklidir.
Premium Dişi/Dişi Jumper Telleri - 40 x 12" (300mm)Adafruit793Breadboard'u LED matrisine bağlamak için tel şerit. Daha uzun olması için erkek pin başlıkları ile uçtan uca bağlanabilir. 1 gereklidir.
Yarım boy breadboardAdafruit64LED matrisi buna bağlanacak ve kültür kabı bunun üzerinde duracaktır.
Minyatür 8x8 Mavi LED MatrixAdafruit956Işık kaynağı. Baskın dalga boyu 470nm'dir (mavi). 1 gereklidir. Aynı satıcıdan alternatif minyatür LED matrisleri baskın dalga boylarında mevcuttur: 624 nm (kırmızı), 588 nm (sarı), 525 nm (yeşil), 572 nm (sarı-yeşil) ve beyaz.
İstiflenebilir başlık-3 pinliSparkFun Electronics138758 gereklidir.
Direnç Kiti - 1/4W (toplam 500)SparkFun Electronics10969Elektronik için. 1 gereklidir.
  IRL520N MOSFETUluslararası DoğrultucuIRL520NDC akımını kontrol etmek için voltaj ayar anahtarı. 4 gereklidir.
Bağlantı Teli - Çeşitler (Katı Çekirdek, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Elektronik için tel. 1 gereklidir.
5V 2A (2000mA) anahtarlamalı güç kaynağı - UL ListeliAdafruit276Isıtma yastığı ve Arduino için güç kaynağı. 2 gereklidir.
12 VDC 1000mA ayarlı anahtarlamalı güç adaptörü - UL listeliAdafruit798Peristaltik pompalar için. 2 gereklidir.
Elektrikli Isıtma Yastığı - 10cm x 5cmAdafruit1481Biyoreaktörü ısıtmak için. 1 gereklidir.
Düşük akışlı değişken akışlı peristaltik pompaFisher Scientific13-876-1Ortam pompalamak için. 1 gerekli
Orta akışlı değişken akışlı peristaltik pompaFisher Scientific13-876-2Kültürü pompalamak için. 1 gereklidir.
9 VDC 1000mA ayarlı anahtarlamalı güç adaptörü - Mikrodenetleyici güç kaynağı için UL listeliAdafruit63. Sipariş 1.
Yüksek Sıcaklık Su Geçirmez DS18B20 Dijital sıcaklık sensörü + ekstralarBiyoreaktör için Adafruit642Termometre. 1 gereklidir.
Micromanager MicromanagerNAÜcretsiz, açık kaynaklı mikroskop kontrol yazılımı "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNA'damevcuttur. Ücretsiz, açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı "http://fiji.sc/"da mevcuttur
Arduino Entegre Geliştirme OrtamıArduinoNAÜcretsiz, açık kaynaklı IDE şu adreste mevcuttur: "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Özel kodGitHubNAÖzel mikrodenetleyici kodu ve "Biyoreaktör Denetleyicisi" eklentisi " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Kablosu A'dan B'ye - 6 AyakSparkFun ElectronicsCAB-00512Verileri mikrodenetleyiciye indirmek için kullanılır. 1 gereklidir.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNALED matris değerlerini bir CSV dosyasından yüklemenin avantajı, görüntü analizi sonuçlarına dayalı olarak bu değerleri güncellemek için eklenti tarafından bir programın çağrılabilmesi ve bu değerlerin mikrodenetleyiciye yeniden yüklenerek geri besleme kontrolünü etkinleştirebilmesidir. Şuradan edinilebilir: " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost jelleri (difüzyon kağıdı)B& HB & H # LOFSFTL
MFR # T1-72		LED matrisi için. 1 gereklidir.
Kit Levha Crosslink 1 / 4x12x24inGrainger, inc20JL37Gemi muhafazasını kültürlemek için siyah köpük. 4 gereklidir.
Standart Fotodiyot Güç Sensörü, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW ThorlabsS120VCIşık yoğunluğunu ölçmek için. 1 gereklidir.
Etiketleme BandıFisher Scientific159015NGevşek bileşenleri etiketlemek ve sabitlemek için. 1 gereklidir.
Kompakt Güç ve Enerji Ölçer Konsolu, Dijital 4" LCDThorlabsPM100DIşık yoğunluğunu ölçmek için. 1 gereklidir.
100mL GL45 hibridizasyon cam şişeBellco Glass, Inc.(7910-40150)Biyoreaktör kabı. 1 gerekli.
Altı liman montajıBellco Glass, Inc.Özel Biyoreaktör kabı için. Boru Özellikleri: .125 "OD x .055" ID. Bağlantı Noktası A: 1.0 "uzun kapak sümüklü böceğinin üstünde ve tüpün altına. Bağlantı Noktaları B, C, E, F: 1.0 "uzunluğunda kapak sümüklü böcek, 33 mm uzunluğunda. Bağlantı Noktası D: 1.0 "uzunluğunda kapak üstü sümüklü böcek, 65 mm & nbsp; uzun aşağıda. 1 gereklidir. 45 mm çapında polipropilen üstü açık vidalı kapak ve kapak ile kap arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için beyaz silikon conta içerir.
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 İnç, 3'lü PaketAmazonB0009F3P3UŞeffaf viski bandı. Bu, diğer birçok satıcıdan edinilebilir. Kültür kabı üzerindeki işaretleri kapatmak ve kapak camını PDMS kanalı ile alüminyum destek çerçevesine sabitlemek için kullanılır.
1/16 "ID x 3/16" OD x 1/16 "Wall Tygon Sıhhi Silikon BoruAmerika Birleşik Devletleri Plastik A.Ş.57288Boru. ~25' gerekli.
Cole-Parmer Twistit beyaz kauçuk tıpa, boyut 10Cole-ParmerEW-62992-32Ortam şişesi tıpası ve atık su şişesi tıpası. 2 gereklidir.
2L Laboratuvar ŞişesiPyrex4980Ortam şişesi ve atık su şişesi. 2 gereklidir.
Gündüz çimdiklemeFisher Scientific5867Tüpleri sıkıştırmak için. 3 gereklidir.
Yedek boru tertibatı 1/16" IDİzlenebilir Ürünler3372Peristaltik pompalar bir dizi tüple birlikte gelir, ancak haftalarca kullanımdan sonra yıpranırlar.
Yedek boru tertibatı 1/50" IDİzlenebilir Ürünler3371Peristaltik pompalar bir dizi tüple birlikte gelir, ancak haftalarca kullanıldıktan sonra yıpranırlar.
Kilit halkalı erkek luer x 1/16" hortum dikeni, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-00Konnektörler. ~10 luer gereklidir.
Kilit halkalı erkek luer x 1/8" hortum dikeni, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-04Konnektörler. Boruyla doldurmak için her kauçuk durdurucu deliği için bir tane olmak üzere 5 adet gereklidir.
Dişi luer x 1/16" hortum dikeni adaptörü, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-00Konnektörler. ~ 10 luer gereklidir.
Dişi luer x 3/16 "hortum dikenli adaptörCole-ParmerEW-45502-08Konektörler. ~ 10 luer gerekli.
Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Dişi Luer Şapkası, Naylon, 25/PkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Erkek Luer Kilit Fişi, Naylon, 25/PkCole-ParmerEW-45505-56
Mikro Delikli PTFE Boru, 0.022 "ID x 0.042" OD, 100 ft / ruloCole-ParmerEW-06417-21Boru. 1 rulo gereklidir.
Masterflex platinle kürlenmiş silikon boru, L/S 13, 25 ftCole-ParmerEW-96410-13Boru. ~25' gerekli.
3/16 "ID x 1/4" OD x 1/32 "Wall Tygon Sıhhi Silikon BoruAmerika Birleşik Devletleri Plastik A.Ş.57293Boru. ~1' gerekli.
Vakum filtresiFisher Scientific974107steril filtreleme ortamı için Nalgene vakum filtresi.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Ortamları havalandırmak ve karıştırmak için çift diyaframlı ayarlanabilir akışlı hava pompası. 1 gerekli. 
0.2 ve mu; m gözenekli şırınga filtresiCorning International431229Bu, akvaryum pompasından gelen havanın cihazı kirletmemesini sağlar. 1 gereklidir.
Slygard 184 Silikon Elastomer KitiDow CorningSlygard 184Mikroakışkan cihaz için. 1 gereklidir.
Amerikan Güvenlik Tıraş Bıçağı GEM Scientific Tek Kenarlı Tıraş BıçaklarıFisher Scientific17989000Tüpleri ve PDMS'yi kesmek için. 1 bıçak gereklidir.
Harris Uni-Core delgeç 1.2mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHMikroakışkan cihazda giriş/çıkış delmek için. 1 gereklidir.
Mikroskop kapak camı 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GMikroakışkan cihaz için. 1 gereklidir.
Kare pencereli dikdörtgen alüminyum çerçeveÖzelÖzelMikroakışkan kanalı desteklemek için. Dış boyutlar: 3 inç x 1,25 inç.
İç kısmalar (kesilmiş kısım): 7/8 inç x 7/8 inç
Kalınlık: ~ 1/32 inç
. PCB'yi mikrodenetleyiciye bağlamak için .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic SystemsContinuous CulturingMicrobial CellsProgrammed IlluminationAutomated SamplingMulti channel MicroscopyChemostat OperationFluorescence IntensitySaccharomyces cerevisiaeOptogenetic Transcription

Related Articles